意得辑国际科研发表学院

从 SARS（非典型肺炎病毒）到 MERS（中东呼吸综合征冠状病毒），再到近来爆发的 SARS-CoV-2（新型冠状病毒），冠状病毒总是打得人们措手不及。与时间赛跑，与疫情角力，有效快速地检测冠状病毒是防控其进一步传播的关键。本文，我们就来聊聊如何构建 ELISA 法快速检测冠状病毒的实验。

01  ELISA 免疫分析 PK 核酸检测法

一般来说，常用的病毒检测手段包括：核酸扩增试验（NAAT，例如实时荧光 RT-qPCR）、透射电子显微镜、免疫组织化学和血清学方法（例如 ELISA 和免疫荧光分析）等。

不同的诊断或研究需求，应选择合适的检测方法。譬如目前 SARS-CoV-2 的临床诊断主要依赖于核酸检测，而针对动物（例如穿山甲和蝙蝠）的大规模筛选项目，为了能更好地解析病毒的起源、传播和进化，以 ELISA 为代表的血清学检测方法除了比 NAAT 更为经济外，还具有如下明显优势：

✦ 血清学筛查所需的设施空间较小，并且可以在现场进行，以最大程度地减少样品运输及周转时间。

为避免 NAAT 中扩增子的交叉污染，其工作流程通常需要四个单独的物理位置：

1. 样品制备（裂解、核酸提取和逆转录）；
2. NAAT 主混合物制备；
3. 模板添加；
4. 扩增和分析。

尽管诸如实时 RT-qPCR 的技术简化了工作流程，但此类要求限制了其在指定区域实验室中执行。另一方面，在病毒灭活后，ELISA 实验可以在任意位置进行。

✦ ELISA 仅需简单的设备，投资较小。

按照标准执行 NAAT，最低要求包括用于预混液制备和样品添加的 UV 安全柜或工作站、PCR 仪、琼脂糖凝胶电泳和可视化设备。为获得更严格、更迅速的检测，还要求使用实时 RT-PCR 仪，所需的初始投资较大，限制了在偏远地区的应用。

✦ 与 NAAT 相比，技术人员进行 ELISA 等血清学检测所需的实验技能相对来说比较简单，只需要稀释和移液技能即可。

✦ 用于扩增子可视化的 NAAT 中常用的核酸染色试剂可能是诱变剂，对技术人员和周围环境造成潜在的健康风险；而 ELISA 使用的化学药品和溶液相对安全。

✦ 最后，也是最重要的，ELISA 检测的灵敏度和特异性较高，甚至是早期诊断或者动物样本。

以 MERS-CoV 为例，通过使用两种 MERS-CoV 核衣壳蛋白特异性单克隆抗体进行 ELISA 分析，该测试可以准确检测低至 10 TCID50/ 0.1 mL 的 MERS-CoV 病毒，并且特异性为 100%。

由于急性感染患者的鼻咽抽吸病毒量约为 106 copies/ mL，病毒的源头宿主中东地区单峰骆驼的鼻腔样本通常约为 104-106 copies/ mL，因此该测试为 MERS-CoV 诊断和筛查提供了足够的敏感性。

采用 ELISA 方法检测 MERS-CoV 核衣壳蛋白^[1]，步骤如下：1）根据「捕获抗体-核衣壳蛋白-检测抗体」的夹心法免疫分析原理，设计 ELISA 实验；2）制备溶液及缓冲液，必要时可使用高压灭菌器或过滤器进行灭菌，以免其它微生物的肽段与目标抗原发生竞争；3）捕获抗体包被微孔板；4）将含有潜在感染性 MERS-CoV 的样品根据规定进行处理；5）样品稀释和孵育；6）偶联 HRP 的检测抗体进行稀释和孵育；7）每个孔加入 TMB 底物溶液，室温孵育后加入终止液终止反应，读板、分析数据。

02  ELISA 检测 S 蛋白，多种方法百花齐放

与 SARS-CoV 相同，SARS-CoV-2 也是通过病毒表面的 S 蛋白结合 ACE-2 蛋白进入细胞的。近日，美国德克萨斯大学奥斯汀分校的 Jason S. McLellan 团队在 bioRxiv 上的论文表明，后者与宿主细胞上 ACE-2 蛋白的亲和力增加了 10-20 倍^[2]。检测 S 蛋白是采用 ELISA 法鉴定 SARS-CoV-2 病毒的有效方法。

尽管两者 S 蛋白的氨基酸序列同源性只有 76.47%^[3]，但是结构总体看来极为相似。

SARS-CoV-2（2019-nCoV）与 SARS-CoV 的结构对比^[2]

Bio-Techne 旗下的子品牌 Novus Biologicals^®  可提供 SARS-CoV ELISA 检测的关键工具：S 蛋白抗体对。

如要定量检测病毒含量，还需使用到标准品蛋白。对于 SARS-CoV-2 的 ELISA 检测，R&D Systems^® 可提供 ELISA 抗体对和标准品定制，以助力更多检测方法的发现，加速疾病的研究进程。

参考资料：

1. MERS Coronavirus: Methods and Protocols.
2. Cryo-EM Structure of the 2019-nCoV Spike in the Prefusion Conformation.
3. Discovery of a novel coronavirus associated with the recent pneumonia outbreak in humans and its potential bat origin.