腺病毒是直径约80-120 nm的无包膜的线性双链DNA病毒，可迅速感染分裂和非分裂期细胞，与细胞表面受体结合后通过内吞作用进入细胞，在细胞核孔附近聚集，并在感染后2h将腺病毒的DNA释放到细胞核中并开始蛋白表达。通过对野生腺病毒进行改造，保留包装信号序列，去除病毒蛋白的编码序列，不仅增加外源基因的装载容量，而且降低细胞毒性和机体免疫反应，从而获得安全性更高的基因导入系统。

锐赛生物提供的是第二代的腺病毒表达系统，是基于人5 型血清型，E1和E3区缺失的复制缺陷型的腺病毒载体，重组腺病毒载体作为基因转移工具的主要优点：

1．可感染大多数细胞类型，可感染分裂和不分裂的细胞，几乎100%的感染效率。

2．比起其他病毒载体来说相对容易得到较高的滴度（可达到1×1012TCID50/ml）。

腺相关病毒(AAV)是一种人细小病毒，目前因为能作为一种基因治疗载体而受到广泛关注。构建重组AAV(rAAV)涉及到用一个目的基因替换病毒基因组的大部分，然后将这个重组基因组包装到一个有感染性的病毒颗粒里。目前大多数生成rAAV的实验方案需要共转染一个载体质粒和一个表达病毒复制和结构基因的包装质粒到腺病毒(Ad)感染的培养细胞中。此方法的局限性包括(1) Ad辅助病毒污染rAAV，(2)rAAV的低产出，(3)生成有复制能力的AAV。在此我们描述了新的辅助质粒(pH3和pH5)，排除了Ad共转染的需求。辅助质粒表达AAV的rep和cap基因和Ad E2A、VAI和E4基因。当辅助质粒在没有Ad感染的情况下共转染到人293细胞中，rAAV载体产量超过了pAAV/Ad包装质粒的80倍。另外，有复制能力的AAV在rAAV制备过程中少于0.00125%。此系统的主要优点是(1)无需感染性的腺病毒(2)只使用两个质粒就提高了转染效率和载体的产出。我们相信该双质粒转染系统因其简便性和高产出而使AAV载体系统能被更广泛地使用。该系统尤其将对多rAAV载体的临床前分析有用

一、实验流程　制备慢病毒表达质粒及其辅助载体，四个质粒共转染293T细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。

二、实验材料　慢病毒载体包装系统为四质粒系统， 组成为Gag/pol、vsvg、rev及pLenti-X-EGFP表达载体。Polo3000转染试剂等。

三、包装细胞293T 细胞的培养
（一） 293T 细胞的冻存
随着传代的次数增加，293T 细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
（二）293T 细胞的传代　

当细胞生长到汇合率达到 80%~90%时需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。

（三）293T 细胞的复苏　

当细胞传代次数过多，细胞状态变差时，或者细胞出现污染事故时，需要丢弃并对最初冻存的细胞进行复苏。

四、慢病毒包装和浓缩
（一）293T 细胞培养，（二）转染，（四）病毒收集，（五）病毒重悬和保存

五、感染目的细胞
不同细胞的MOI 不同，在病毒感染目的细胞前，需要做预实验以确定细胞最佳MOI以及是否需要加入辅助增强剂Polybrene。

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（一） 实验流程（1和2为并列步骤）
1.慢病毒过表达质粒载体的构建
设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因CDS区（coding sequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。
2.慢病毒干扰质粒载体的构建　合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体
3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化
2.1慢病毒载体、包装细胞和菌株
该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2。其中质粒上的ZsGreen1表达框能表达绿色荧光蛋白（GFP）。

（二） 载体信息

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1、将目的基因导入细胞实现相关功能研究，特别是对难以用转染方法实现导入的细胞；

2、将目的基因导入细胞系构建稳转株，使其目的基因能稳定表达，实现相关功能、药物的研究。

3、将过表达目的基因导入细胞系，构建能生产目的蛋白的真核细胞。

4、将目的基因导入动物组织、体内获得长期表达。

5、基因治疗。

6、转基因动物
7、基因敲除
8、药物研究：构建表达受体蛋白的细胞系，研究药物的作用
9、快速建立生产目的蛋白的细胞系，非常有前途的真核细胞表达方法

1. 菌液的准备

a) 取含目的质粒的甘油菌液（-80℃或-20℃冰箱中），待菌液融化后，在超净台用接种环划线于氨苄抗性的平板上，37℃倒置培养12-16h。待平板长出菌落，挑选生长状态良好的单克隆菌落。若无目的质粒的菌液，则需取库存质粒进行转化，然后挑单克隆摇菌。

......

2. 腺病毒质粒的抽提（参考AxyPrep™ 质粒小抽试剂盒说明书）

a) 取250ul 已加入RNase A 的Buffer S1 对细菌沉淀进行悬浮，将细菌沉淀吹打需均匀，不应留有小的菌块。

b) 取250ul Buffer S2加入到上述菌悬液中，温和并充分地上下翻转6-8 次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液；

c) 取250ul 4℃预冷的Buffer S3加入到上述溶液中，温和并充分地上下翻转10 次混合均匀，直至形成紧实的凝集块，室温放置5 min。

d) 将上清转移到小抽制备管中，4℃ 5000g 离心1min，然后将小抽制备管从2 ml 离心管中取出，弃离心管中的滤液。

......

3. 腺病毒质粒初液的酶切线性化

......

4. 线性化的腺病毒质粒纯化

a) 将上述过夜酶切的产物短暂离心，转移至已灭菌的进口EP管内；然后加入200 ul（等体积）氯仿，上下颠倒混匀， 12000 rpm离心10min。

......

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1. 细胞的准备

a) 复苏293细胞，传代培养1-2代，调整好细胞状态，务必4代以内完成转染实验。

b) 在转染前1天，用胰酶消化传代，将5×105细胞接种于6孔板或87.5px皿中，加入2ml完全培养基（DMEM+10%FBS+1%P/S+1%Glutamax），摇匀后置于5% CO2、95% 湿润空气、37℃培养箱中培养，以保证次日转染时细胞密度达70%左右。

2.  转染

a) 转染当天，从293细胞中移除培养基，分别换上新鲜的1.8ml DMEM+10%FBS培养基（不含抗生素），37℃孵育2h。

b) 配制转染试剂混合物

c) 使用转染试剂POLO3000：

d) A管：将4ug DNA与 100ul DMEM（基本），混匀；

e) B管：将6ul POLO3000与100ul DMEM（基本），混匀；

f) 室温放置5min后，将A管与B管溶液混合，轻轻混匀室温孵育15-20min；

g) 将上述复合物均匀滴加到293细胞中，轻轻摇匀细胞培养板，37℃培养箱中孵育。

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摘要:

构建重组AAV(rAAV)涉及到用一个目的基因替换病毒基因组的大部分，然后将这个重组基因组包装到一个有感染性的病毒颗粒里。目前大多数生成rAAV的实验方案需要共转染一个载体质粒和一个表达病毒复制和结构基因的包装质粒到腺病毒(Ad)感染的培养细胞中。此方法的局限性包括(1) Ad辅助病毒污染rAAV，(2)rAAV的低产出，(3)生成有复制能力的AAV。此系统的主要优点是(1)无需感染性的腺病毒(2)只使用两个质粒就提高了转染效率和载体的产出。我们相信该双质粒转染系统因其简便性和高产出而使AAV载体系统能被更广泛地使用。该系统尤其将对多rAAV载体的临床前分析有用。

1．简介
腺相关病毒(AAV)是一个常见的人细小病毒，自然缺陷、无包被和无致病原性。AAV复制周期由两个明显的阶段构成：潜伏期和增殖期...

2.材料和方法
2.1. 质粒、细胞和病毒

2.2. rAAV载体产生和滴定

2.3 蛋白质分析

3.结果
3.1 用AAV/Ad辅助质粒的rAAV包装

3.2. Rep和Cap蛋白质表达

3.3.病毒DNA分析

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1. 腺病毒感染目的细胞

a) 根据后续实验所需细胞量选取合适的培养介质，准备足够量的细胞（后续以6孔板为例进行讲解）。

b) 于感染前一天，利用胰蛋白酶消化目的细胞，细胞计数，接入M个细胞于6孔板中，使细胞置于2ml含DMEM或1640完全培养基中，5% CO2、37℃培养。感染前细胞调整至融合度50%。

c) 感染当天，镜检接板的细胞状态是否健康，培养基是否干净无杂质。如果培养基中代谢物或死细胞较多，从目的细胞中移除培养基，PBS清洗一遍，分别换上新鲜的培养基，否则不做处理。

d) 根据目的病毒的滴度、摸索的MOI值，计算好需要加入的病毒用量，将病毒加入1.5ml EP管内

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2. 慢病毒感染目的细胞

a) 根据后续实验所需细胞量选取合适的培养介质，准备足够量的细胞（后续以6孔板为例进行讲解）。

b) 于感染前一天，利用胰蛋白酶消化目的细胞，细胞计数，接入M个细胞于6孔板中，使细胞置于2ml含DMEM或1640完全培养基中，5% CO2、37℃培养。感染前细胞调整至融合度50%。

c) 感染当天，镜检接板的细胞状态是否健康，培养基是否干净无杂质。如果培养基中代谢物或死细胞较多，从目的细胞中移除培养基，PBS清洗一遍，分别换上新鲜的培养基，否则不做处理。

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病毒包装离不开细胞转染，而细胞转染成功很大程度上取决于细胞状态的好坏，细胞状态的好坏又由什么决定呢，除去一些不可抗性因素，最重要的应该就是给它们提供营养物质的培养基了吧。因此，培养基对于病毒包装很重要，选择合适的培养基对于病毒包装成功有着至关重要的作用。这里，我们就简单介绍一下几种常见的培养基以供大家实验中参考：经典的培养基有很多种，Invitrogen （GIBCO），Thermo Fisher（HyClone）， Sigma 等公司都可以提供。 其中DMEM、 RPMI1640、MEM、DMEM/F12都是应用最广泛的培养基。其他如M199、IMDM、L15 培养基等也用于某些细胞的培养。

MEM是由 Eagle‘s 基础培养基（BME）发展而来的，其中增加了组分的范围及浓度。

Dulbecco 改良的BEM（DMEM）培养基是为小鼠成纤维细胞设计的，现在常用于贴壁细胞的培养。DMEM的氨基酸浓度是MEM 的两倍，维生素浓度是MEM的4倍，采用双倍的HCO3-和CO2 浓度起到更好的缓冲作用，最初的配方中葡萄糖含量为 1000mg/L，后来为了某些细胞的生长需要，将葡萄糖含量又调整为4500mg/L， 这就是大家常说的低糖和高糖了。aMEM 含有附加的氨基酸，维生素以及核苷和脂肪酸， 它可广泛应用于各种细胞类型，包括对营养成分要求苛刻的细胞。

Ham’s F12 是为在低血清浓度下克隆 CHO 细胞而设计的，现在也广泛应用于克隆形成率的分析及原代培养，F12 还可以与DMEM等体积混合使用，得到一种高浓度与成分多样化相结合的产物。这种培养基已应用于许多原代培养及更难养的细胞系的培养。但如果你是着手建立一种全新细胞的培养体系，根本找不到任何参考，那你就得花点时间自己试验了。万事开头难嘛。 因为没有一个标准答案。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做贴壁细胞培养，RPMI 1640做悬浮细胞培养会是一个好的开始。 你也可以购买几种培养基来， 然后花大约两周的时间做一种。

RPMI1640培养基是专为淋巴细胞培养而设计的，现在已广泛应用于悬浮细胞的培养。以前经常听到有人问， 这种细胞该用哪一种培养基呢 ？其实这个问题的答案可以很简单， 也可以好复杂。 此话怎讲，如果这种细胞是购自ATCC 或其他的细胞库，那很简单， 问供应商就行了。或者找到相关的文献，作为参考。Invitrogen 网站上有一个 Cell Line Database 的工具，也很好用。选择你感兴趣的细胞类型，它就会弹出推荐的培养基，血清和转染试剂等，有时还有优化好的转染步骤，很方便。Sigma 网站上也有一个Media Expert，包括了培养基所有成分的功能描述，使用推介和参考文献等；它还是一个解决问题能手，对于细胞培养中的常见问题，如细胞贴壁不好、培养基变色等，它都会列出可能的原因，并提供补救办法。这个Expert 果然不简单！

1. 细胞的准备

测定前一天，将用于测定滴度的293T细胞铺板， 96 孔板，每个孔加4×104个细胞，体积为100 μl。

2. 病毒滴度测定

根据病毒的预期滴度，准备 5-7 个无菌Ep 管。在每个管中加入117 μl 的无血清培养基。

a) 取待测定的病毒原液 13μl 加入到第一个管中，混匀后，取10 μl 加入到第二个管中。继续相同的操作直到最后一管。

b) 稀释度说明：

c) 第一个Ep 管中加入10ul 病毒原液，记为1E+1 μl；

d) 第二个Ep 管中进行了第一次十倍稀释，所得病毒原液为第一个Ep 中的1/10，记为1E+0 μl；

e) 第三个Ep 管中进行了第二次十倍稀释，所得病毒原液为第二个Ep 中的1/10，记为1E-1 μl；

f) 依次类推…

g) 第七个Ep 管中进行了第六次十倍稀释，所得病毒原液为第六个Ep 中的1/10，记为1E-5 μl；

h) 第八个Ep 管中进行了第七次十倍稀释，所得病毒原液为第七个Ep 中的1/10，记为1E-6 μl；

i) 选取所需的细胞孔，吸去90ul培养基，加入90μl稀释好的病毒溶液，放入培养箱培养。

j) 24小时后，加入完全培养基100μl。小心操作，不要吹起细胞。

k) 4天后，观察荧光表达情况，并数出最后2孔含有荧光细胞的孔中的荧光细胞。

l) 计算滴度：

m) 计算举例：

n) 根据以上视野中GFP 表达情况，若在加入1E-5 μl 病毒原液的孔中观察到2 个带有荧光的细胞，说明该孔中至少有2 个病毒颗粒感染了细胞，则该病毒的滴度等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量，本例子中就是2/（0.9E-5）=2E+5，单位为TU/μl，也就等于2E+8TU/ml。

1. 病毒长期储存于-80℃冰箱，-20℃保存不要超过1周，4℃保存不要超过3天。

2. 病毒的运输采用干冰，收到病毒液后若几天内用于实验，可于4℃保存（于3天内用完）。若短时间内不用，收到病毒后应立即放入-80℃冰箱进行长期保存。病毒使用过程中要避免反复冻融，否则会降低病毒滴度。

3. 一般病毒可在-80℃存放1年，但存放时间超过6个月后使用，需重新检测病毒滴度。

4. 需要稀释病毒时，将病毒从-80℃冰箱中取出，置于冰上溶解，然后用PBS或培养基（不含血清）稀释到所需浓度后轻柔混匀，尽快使用。

锐赛生物提供的是第三代的慢病毒载体系统，包括1个慢病毒表达载体和3个包装辅助质粒，大大降低了发生同源重组的概率，降低了产生复制能力病毒的可能性。同时，本系统的慢病毒颗粒是自身失活型（SIV）病毒，即病毒感染靶细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒，从而提高了安全性。

尽管如此，该病毒仍然具有潜在的生物学危险，因此建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假病毒，除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假病毒进行生物学实验。此外，建议将本系统生产的慢病毒视为二级生物安全水平的生物，使用时请参照如下基础规范进行实验：

1. 在进入实验室工作时，穿着实验服或隔离服，戴上手套和口罩。

2. 操作病毒时请尽量使用生物安全柜，小心不要产生气雾或液体飞溅。

3. 如果使用普通超净工作台操作病毒，请在打开含有病毒的容器盖子前关闭超净台的风机（由于超净台风向外排，有可能将病毒吹向操作者），并尽快操作；尽量缩短开盖后的病毒在关闭了排风机的超净台中停留的时间，封闭所有含有病毒的容器、耗材、废液后，再打开超净台风机。

4. 如果操作时台面有病毒污染，请立即用75%酒精加1%的SDS 溶液擦拭。接触过病毒的枪头，离心管，培养板，培养液请用75%酒精加1%的SDS 溶液或于84 消毒液浸泡过夜后弃去。

5. 如需离心，应使用密封性好的离心管，或用封口膜封口后离心。

6. 实验结束，脱掉手套前先消毒再摘除手套，随后用肥皂洗手。

详细操作规范请参阅卫生部发布的《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》（WS233-2002）、美国疾病控制中心出版的《微生物和生物医学实验室生物安全（第五版）》和世界卫生组织出版的《WHO生物安全手册》。

不同的滴度单位表示取决于不同的病毒滴度测定方法，这些方法分为两类：物理测定方法（包括VP/ml）和生物学测定方法（PFU/ml、TCID50/ml等）。

Ø VP：病毒颗粒(Viral particles)，是有感染性（“活”）和无感染性（“死”）的病毒颗粒的总量。由于在病毒制备过程中，每次活/死细胞比率都不同，VP并不能反映有活性的病毒的数量。测定方法是分光光度计测定OD260。

Ø PFU：空斑形成单位（plaque formation unit），代表具有感染能力的病毒的总量，感染性滴度的单位表示为PFU/ml。检测方法是将腺病毒经过一系列梯度稀释后感染293细胞，病毒吸附后再覆盖一层融化的半固体营养琼脂，使病毒在单层细胞培养中有限扩散，通过统计空斑计算滴度。由于测定pfu往往重复性较差，因此近些年许多研究又开始采用TCID50方法来计算病毒的感染单位。

Ø TCID50：Tissue culture infective dose，指能在半数细胞培养板孔内引起细胞病变(cytopathic effect, CPE)的病毒量。测定方法是将病毒液作10倍系列稀释，分别接种细胞，经一定时间后观察CPE，以最高稀释度能感染50%细胞的量为终点，最后用统计方法计算出50%组织细胞感染量。

Ø TCID50与 PFU换算：PFU＝0.7×TCID50的滴度

MOI 是multiplicity of infection 的缩写，中文译为感染复数。传统的MOI概念起源于噬菌体感染细菌的研究。其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。噬菌体的数量单位为pfu。一般认为MOI 是一个比值，没有单位，其实其隐含的单位是pfu number/cell。后来MOI被普遍用于病毒感染细胞的研究中，含义是感染时病毒与细胞数量的比值。

然而，由于病毒的数量单位有不同的表示方式，从而使MOI 产生了不同的含义。能产生细胞裂解效应的病毒例如腺病毒、单纯疱疹病毒等习惯上仍用pfu表示病毒数量，因此其MOI 的含义与传统的概念相同。而对于某些病毒如AAV病毒，无法用pfu 表示病毒的数量，而是采用TU、IU、病毒颗粒（viral particles,v.p）或基因组数量（vector genome,v.g.）来表示病毒数量，因此其MOI 就有了不同含义。采用TU 或IU，MOI 的含义便是TU number/cell 或IU number/cell。采用v.p.，MOI 的含义便是v.p. number/cell 。采用v.g，MOI 的含义便是v.g.number/cell。
可以将上述不同的MOI 表示方式分为2 种：
1） 以活性单位表示病毒数量，如pfu, TU, IU。这时MOI 的含义是指平均每个细胞感染病毒的活性单位数。
2） 以病毒颗粒或基因组数表示病毒数量，如v.p. 或v.g. 。这时MOI 的含义是指平均每个细胞感染病毒的病毒颗粒或基因组数。
值得一提的是，上述2 种不同的MOI 表示方式在含义和数值上都有所不同。前一种是传统意义上的MOI，后一种MOI 表示方式的含义更为简化和直观，也逐步被一些研究者采用。传统意义上的MOI 的测定，其原理是基于病毒感染细胞是一种随机事件，遵循Poisson 分布规律，可计算出感染一定比例的培养细胞所需的感染复数（MOI）。
其公式为：
P(k) = 1- P(0) ,P(0) = e-m 或m = -InP（0）。
其中：
P(k) 为被感染细胞的百分率，P(0)为未被感染细胞的百分率，m 为MOI 值
例如，如果要感染培养皿中99%的培养细胞，则：
P(0) = 1% = 0.01，m = -In(0.01)= 4.6 pfu/cell。
由此可以看出，由于病毒特性和研究者习惯的不同，MOI 的单位由原来约定俗成的pfu number/cell 变成多种表示单位。在阅读文献和写作论文时，应注意MOI 的具体含义和单位。