Holden T. Maecker *, Joseph Trotter BD Biosciences, 2350 Qume Drive, San Jose, California 95131
关键词：阴性对照，设门，特异性，荧光补偿，仪器设置
摘要
摘要：使用流式细胞仪分析的主要目的在于区分细胞对于检测指标是阳性还是阴性，或精确计算阳性细胞与阴性细胞的比例。这就需要准确的仪器设置及良好的实验重复性，分析时运用恰当对照及分析方法。各种不同的流式细胞仪实验需要不同的阴性对照，因而也是一些争论及讨论的焦点。在本教程中，我们将对照划分为不同的种类，介绍了各种类对照的选择条件及其优点。
对照样本在流式细胞仪分析中至关重要，因为研究者需要通过它来解释分析样本。任何实验可能，或者说需要，最少包括三种对照：设置（仪器）对照，特异性（设门）对照和样本间比较对照。在一些情况下，同一个对照管可能具有一种或几种以上的功能。设置或仪器对照是指那些用于正常设置（或是检测是否正确）仪器的样本，其中包括光电倍增管电压、增益和荧光补偿的调节。特异性或设门对照是指那些用于区分特异染色与非特异性染色的样本。这些对照常用于设定线性门或图型门的位置。换言之，它们是用于决定某些指标阳性或阴性的标准。样本间对照是指那些可提供样本间相关对比条件的对照，如未染色的样本或正常人样本。在某些情况下，这些对照可作为设门对照使用，如未刺激的样本可作为定义细胞因子分泌阳性/阴性的标准。在以下章节中，我们将详细讨论这三种类型的对照。
设置对照
流式细胞仪某些技术参数，如激光器校准、激光时间延迟、灵敏度等需要周期性地校准，但可能不需要在每个实验中都包括这些对照。控制、监测这些技术参数暂不在本文的讨论范围之内，所以我们假定流式细胞仪处于良好、稳定的工作状态，并且适当的仪器质控检测在日常中定期执行。每个实验可因检测不同的标志物或使用不同的荧光素，而所需特定的设置对照。流式细胞仪的设置和优化可因不同的流式细胞仪（模拟或数字）或不同的实验而各不相同（双色或多色实验）。但是任何多色实验设置（将发生荧光渗漏）都必须包括两个要素：（1）设定仪器的增益（如光电倍增管的电压）和（2）调节荧光补偿。因为计算荧光补偿值与电压密切相关，这些步骤必须按步实施，除非流式细胞软件具有随PMT电压的改变而计算补偿之功能。
设置光电倍增管电压
PMT电压有时是通过未染色样本中的细胞进行设置的。在这个方法中，调节要检测荧光的PMT电压，使未染色的细胞落在四次方对数坐标的第一次方内。然而这个方法在一些条件下并不能提供准确结果，它并不是永远有效的。此方法特别不适于与在使用长波长荧光素情况下应用，如APC、CY7、Alexa700等。这是因为在这个波段中，未染色细胞的自发荧光强度几乎接近于零，此时的信号主要是由光电倍增管及电子噪音信号构成。如果在这些荧光通道中要通过改变电压将未染色细胞调节到一次方位置中，通常是困难且主观的，它并不与实际中细胞在此通道中信号相一致。
因此，需要谨慎调节这些通道中电压，确保各个探测器有足够的增益将细胞的弱信号放大而覆盖原来的电子噪音信号。在实验中这些探测器的电压设定可由电压基准值开始进行调节。对于弱荧光的最低灵敏度或者是检测弱表达群体的能力，可由弱荧光微球的CV值来调节。在各个荧光通道中，越是高的群体荧光强度，则其中电子噪音信号对于其CV的影响就越低。通过选择与细胞染色后弱表达荧光类似的微球，然后通过调节探测器的电压将群体调节到不同的区域，就能获得群体CV与电压之间的关系图（图1）。通过曲线我们可得知这样一个趋势，样本的CV值着增益的增高而降低，只有当电压足够高时，才能使电子噪音信号对样本信号影响最小。当未染色细胞或弱荧光群体与微球相近时，每个曲线的转折点可视为获得最佳灵敏度时所需的最低电压值。此时PMT电压可能可作为基准电压来保证仪器在检测弱阳性荧光时具有最高的灵敏度。
图1：（A）通过分析弱荧光微球来显示相应探测的特征。[SPHERO多色校准微球]
可见观察到Log PMT电压值与荧光强度之间有线性关系。标准差和CV与荧光强度之间也具有关系。因为log PMT电压值与荧光强度呈高度线性关系，并且因为标准差被包含于CV值中，故实验者仅需简单通过CV与PMT电压之间的图谱来了解探测器的特性。使用488nm激光激发Peak2微球，可得到一些通道CV与电压值的图谱。各个曲线的转折点则代表了各通道获得最佳灵敏度时所需的最低电压值。注意此方法仅当荧光微球与染色细胞自发荧光或弱阳性表达强度一致时适用。在模拟信号的仪器上，通过检测弱荧光微球的CV值可以获知电子噪音本底信号，从而来优化PMT电压。实验者也可以通过检测混合有阴性颗粒和阳性颗粒的样本来获得仪器的信噪比（阳性群体荧光中位值/阴性群体荧光中位值），此时实验者可获得一个与图1相反的曲线。同样，曲线的转折点也代表着获得最高灵敏度时所需的最低PMT电压值。
以上确定PMT基准电压的方法并不需要在已有优化检测条件的仪器上执行，除非仪器或分析细胞自发荧光发生了显著改变。它只需要在滤光片、PMT、激光器或荧光素改变时需要执行。然而这些基准电压在每个实验中并不会自动更新。对于某些细胞类型、不同荧光的抗体组合和不同的实验方案（如表面和胞浆内染色），以上方法要作相应的调整。这就需要完全染色的样本来识别细胞群体，理想状态中最好在同一实验中存在阴性及阳性的群体。
当使用仪器基准电压来检测这种完全染色的样本时，在什么情况下还需要进一步调节探测器电压呢？最重要的是如果阳性信号已过高超过坐标时，则需要降低PMT电压使所有群体回到坐标轴上。这并不是因为美观的原因，而是因为超出坐标的信号无法被统计，并且这些信号还会对其他荧光通道造成影响。其二，如果已知的阴性群体出现在荧光高亮区域，你或许需要调低PMT电压直至阴性群体的左侧到达在使用基准电压检测的未染色样本群体的右侧边界。然而这种方法并不是一直有效的，因为它有可能会引起错误检测已经过荧光补偿的群体。当遇到高本底样本时（此时阳性信号仍在坐标轴内），首先建议想办法去除高本底信号，如降低抗体滴度（或选择高效价抗体）、增加洗涤步骤、使用未标记的不相关抗体或FC阻断抗体来封闭非特异性结合。
荧光补偿设置
荧光渗漏是绝大多数多色实验中不可避免的，很容易发生，需要在随后的数据中通过补偿方法将这些影响去掉。最后的结果是，无论细胞群体在别的通道内荧光如何，在一个通道内荧光强度相同的不同细胞群体其平均荧光强度相似。尽管多数模拟制流式细胞仪具有荧光补偿电路，但需要注意的是荧光补偿是与实验密切相关的，而非是一种仪器设置。各个荧光探测器增益一旦确定后，荧光补偿设置也变得很直观，因为各个荧光渗漏很容易检测到。但荧光补偿操作会使阴性群体在一个或多个补偿过的荧光通道中分布分散，但这图形比未经补偿的数据容易分析得多。检测荧光补偿调节是否正确需使用某些对照品，最常用的是一组微球或细胞样本--荧光抗体单染某个标志物后检测。通过仪器本身或软件可计算出正确的荧光补偿。荧光补偿设置一定是在PMT电压设定以后进行，因为荧光补偿的多少程度与电压直接相关。然而一些新流式用户由于经验问题没有能力在PMT电压发生改变后去重新调节荧光补偿。
在许多情况下，使用单染样本作为补偿对照是有效的。这种方法的缺点是必须在原样本中抽取些细胞或另外寻找细胞来源。第二年缺陷是，当检测指标是弱阳性/阴性或只有极少细胞表达，这时依靠抗体染色调节补偿就变得十分困难。如遇这种情况，可使用相同荧光标记的其他抗体来染色作为补偿对照。实际上，许多研究者都使用一种抗体，如CD8（在某些细胞群体上强阳性表达）来调节各个通道的荧光补偿。在多数情况下这是一种完美的方法，因为通过相等或更强的荧光信号可精确调节补偿。
在调节某些复合荧光素的补偿时难度会很大，特别的APC-Cy7和PE-Cy7。这些荧光素发射波长的批间差异比较大，会影响荧光渗漏的稳定性，同时它们还受抗体保存和样本染色的影响。当使用这些荧光素时，使用不同的抗体来调节补偿可能会影响荧光补偿的精确性。
有两种类型的微球可用于染色细胞的荧光补偿调节：标记有荧光素的微球，或是能够捕获用户所有荧光抗体的微球。前一种微球标有稳定的荧光素在许多检测中可方便使用，通常它是由厂家配套相关的软件自动调节荧光补偿，多见于临床检验科中使用。然而当在实验中使用APC-Cy7 或PE-Cy7荧光时，这些样本由于受上面介绍的因素影响，很难在各通道中精确调节荧光补偿。因此如果实验中使用这两个荧光素需十分小心。
捕获微球具有以上两种方法优点：它们像细胞一样与抗体结合，但因为它们与抗体结合没有特异性，所以它们与细胞不同，可为各抗体提供强烈、统一的荧光信号来调节补偿。并且很少出现细胞染色信号强于捕获微球的情况。捕获微球还能与染色样本在同一实验条件下进行操作（固定、破膜、温度、曝光），此法对于复合荧光素也具有高灵敏度。使用捕获微球的主要注意点是它们的光散射门与细胞不同，另外它们只捕获某些亚型的抗体（如标有抗小鼠kappa轻链的微球难与小鼠抗体结合）详情见BD Biosciences公司资料。故如要使用这些微球来进行补偿调节需要对捕获微球及抗体有充分的了解。
特异性（设门）对照
一旦PMT电压及样本荧光补偿设定后，便可采集并分析实验样本了。此时可能需要对照来帮助设门或确定数据中阴或阳性界线了。这些门将回答流式细胞仪分析中最重要的问题：对于某一指标，哪些细胞是阳性或阴性，或多少比例的细胞是阳性的。因此，设门对照在分析数据时具有极为重要的作用。
或许您会问何时设门对照是真正需要的。当然，某些门可在没有任何对照情况下任意设定。如那些表达明确的生物学指标，阳性与阴性群体没有任何交叉，此时无需对照来准确设定区分阳性或阴性群体。最常见的如T细胞表面CD4和CD8。此处需要注意的是在某些情况下，可能会出现弱阳性表达的细胞群体（如细胞发功能性应答后），此时需要考虑是否要将这此弱阳性群体归入阳性门内。
设门对照在那些阴性、阳性细胞群体分布不清晰的样本中至关重要。某些活化标志物，如CD25、CD38、CD69和一些细胞因子都属于此范畴。对于这些标志物的设门对照可能是生物对照样本（未刺激样本或无效刺激样本），或使用更为通用的对照，如同型对照或荧光扣除对照（FMO）。
同型对照
同型对照在流式细胞仪中应用已有很长历史，用于定义某一荧光标记抗体在染色中的非特异性结合。找到与抗体匹配的同型对照十分重要，图2说明了不同亚型抗体的同型对照具有不同的染色本底。然而，即使同型对照与抗体相匹配，使用此同型对照还主要存在两大不足。第一个不足是每个荧光标记抗体都具有特定的染色本底，取决于它们的特异性、浓度、聚集程度、荧光分子数量/抗体比例及其他因素。因此寻找一个与抗体染色背景完全匹配的同型对照是很难的。但是我们却是使用同型对照来帮助定义背景染色的水平，因此这是不足之一。第二点不足是同型对照其本身并不能定义由其他荧光通道渗漏而来的荧光。这个问题可通过在染色时除同型对照外还加入所有其他通道的抗体来解决。但即使这个问题全部解决，仍会受第一点不足的影响，即无法找到与染色抗体背景信号完全一致的同型对照。
FMO CONTROLS
当使用一定浓度的高质量荧光标记抗体时，它们此时的染色本底相对较低。在这种情况下，如果在检测中运用荧光数量>4时，此时的染色本底基本源于荧光渗漏。因为这个原因，使用荧光扣除对照变得流行并更为谨慎。FMO对照是指样本中加入除一个抗体以外的所有染色抗体。没有加入抗体的通道中信号则是FMO对照所提供的设门界线。
了解FMO对照能够提供和不能提供什么信息十分重要。它能提供测量由其他通道渗漏而来的信号的线索。故它在测试新的多色方案，需要在某一通道中获得最高分辨灵敏度时十分重要。因为在所研究的通道中并不存在任何抗体，FMO对照并不能提供该通道抗体实际染色本底的情况。当抗体染色本底与荧光渗漏引起的本底相比并不重要时，以下情况便无需担心了。但是如果抗体染色样本显得更为重要时，单独使用FMO对照来决定阴性/阳性界线便不再适合了。一个重要问题：FMO或同型对照是否在每个实验中的每个样本都进行检测。一般来说，实验者不希望出现不同样本源染色时荧光渗漏量发生显著变化，但因为不同抗体结合浓度不同而造成荧光渗漏也不尽相同。同样的，抗体染色本底应该相对稳定，但由于样本之间的差异其本底也会有所不同。因此，最保守的方法是为每个样本都作对照，但如果进行大批量检测时，这可能会显著增加成本及劳动量，所以此时会对样本检测其对照是否存在差异。
简言之，同型对照和FMO对照是最为常用的设门对照。本节前半部分讨论了由于抗体非特异结合而形成的本底，但通过同型对照并不能为所有的抗体精确去除本底信号。后半部分讨论了由于荧光渗漏而引起的本底信号。FMO对照则通常在多色分析中使用，去除由于荧光渗漏而引起的本底信号。并不是在检测任何指标时都需设立这些对照，只是当阳性、阴性群边界不清时需要设立。
生物比较对照
有些研究者可能相信如果实验过程中不包括有特异性的对照，如同型对照，则该实验是不完整的。然而，通常只有生物对照样本更适合于定义阴阳必界线。比如在细胞活化检测中，未刺激（或无效刺激）的样本同常能提供最佳的区分阴阳性细胞。（如图3）这些对照在绝大多数情况下比同型对照或FMO对照更为适合（除了当未刺激样本的背景信号过高而未能区分阴阳性界线的情况下）。这是因为，与FMO对照相似，未刺激样本作为对照已经所有抗体染色，可去除由于荧光渗漏而引起的本底信号。并且它又如同同型对照，可去除抗体的非特异性染色。并且因为相同的抗体存在于其他检测样本中（与对照不同的只是经过的刺激），故不再需要使用同型对照来匹配非特异性结合了。因此，生物比较对照是最适合于定义检测样本的阳性范围的。实际上，某些学者认为这种对照极其重要，他们重复检测几次后，在其后的测定样本中扣除这些本底，此时的检测精度会更高。
除了将未刺激样本作为对照，阳性的生物比较对照也同样重要。在功能检测实验中，这些样本可能被一些活化剂所刺激，如SEB、PMA、ionomycin或是一组由高反应性的多肽组合。设立阳性对照的目的是发现测试样本中潜在阴性群体。换言之，如果实验按这种方法进行，则可保证细胞的反应可被检测到，如果样本中的细胞存在问题也可被及时发现。这就预防了由地试剂未加或细胞死亡而得到的假阴性结果。最为合适的阳性对照样本需满足以下条件：（1）所有被检测的细胞（或至少有多数）是阳性的，（2）阳性对照的活化生理反应与检测样本中的相似。多肽混合物刺激的阳性对照最符合第个二条件，但或许无法满足第一个条件。PMA1+ionomycin能满足第一条却不满足第二条。SEB或其他超抗原较为适合，当却不是完全满足两个条件。
非刺激类检测可能也需要生物比较对照来合理地解释数据。比如在比较疾病状态与正常状态下表型的变化，就需要在每个实验中都包括比较对照。因为样本处理过程中的变异，所以需要将正常人或病人的样本同时进行处理。
最后可使用质控细胞群体来进行纵向比较。这可通过分管冻存典型样本的PBMC，然后在每个实验时取出进行检测来完成。此时可要求对照细胞的检测结果落在某一范围之内，从而使得检测数据可信。此外质控细胞还可用于仪器的设置。因此用于此目的的保存或冻干的细胞标准品已商业化可购买后直接使用。
结论
在流式细胞仪实验中最为基础的问题是哪些染色的细胞是阳性或阴性，或对于某一标志物阳性细胞或阴性细胞的比例是多少。要精确回答这个问题需要仔细调节仪器并使用对照品。首先，探测器的增益需调节准确从而获得最佳的灵敏度，荧光补偿必须设置正确，从而避免出现虚假或不必要的错误结果。第二，对于没有明显双峰分布（阳性峰）的样本，需要做设门对照。在某些情况下，生物比较样本（如未刺激的细胞）可提供最佳的设门对照来决定细胞阳性范围。在某些不可能获得生物比较样本的情况下，可使用同型对照或FMO对照。以上这些并不是所有的选择，选择何种方式取决于是荧光渗漏或抗体非特异性结合对实验的影响大小。最初，可通过检测多种对照来决定哪一个更适合于定义阳性、阴性界线。在任何实验中都须避免因为没有充分考虑而使用不恰当的对照品。坚持使用经实验证明的设门方法将有助于标准化流式细胞仪分析项目来解答重要的临床问题。
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老版主很久没光顾了吧...欢迎多加光临....
Martine4720，很久未见，您们辛苦了。
笑佛 wrote:
Martine4720，很久未见，您们辛苦了。
还是回来吧...目前人手很缺!!!!