作为在实验室奋斗的「奋青」们，都知道 Realtime PCR(RT-PCR) 是并列于 western blot 的基础实验之一。不会做 PCR 的人都不好意思说自己在搞科研，呵呵哒。作为一门核心技术，也是相对来说出结果快速的技术，本次小笔将一改逗比风格，高冷正经脸来分享该技能，各位接好了啊。
RT-PCR 原理的话简单来说，就是采用荧光基团标记的特异性探针来跟踪 PCR 产物，做到全程监控，后期结合电脑软件分析定量得出待测样品的初始量。步骤如下：
RNA 提取和测定
1. 平衡：-80℃ 取出 TRIZOL 裂解的细胞（也可以当时裂解；如果是组织，需要超声破碎后再进行后续步骤），置于室温使其完全溶解（3-5 min 左右）；
2. 分离：随后按照裂解液：氯仿（5：1）的比例加入氯仿，剧烈震摇 30 S（自认为手劲儿大的就手动摇，扛不住的话也可以涡旋仪，当然我是一直手动的哈哈）后，室温静置 3 min，4℃，13,000rpm 离心 10 min，取上清置于干净的 RNAfree 的 EP 管中。【小提示：取上清的时候很容易将中间层的絮状物吸出，导致蛋白质污染，可以采用 PhaseLock Gel 的离心管，有效分层水相和有机相，避免吸取的上清混杂杂质。】
3. 沉淀：在上清中加入等体积的异丙醇，轻微上下翻动混合，冰上孵育 20 min 后，4℃，14,000rpm 离心 20 min，管底部有可见沉淀，即为 RNA（如果裂解的细胞较少，沉淀可能肉眼看不见）。
4. 清洗干燥：轻柔的倒掉上清，每管加入 1 ml 75% 乙醇溶液（采用 DEPC 水配置），混匀，4℃，14,000 rpm 离心 15 min。小心倒掉上清，于超净台边缘干燥 5 min。
5. 溶解测定：根据具体的 RNA 的量，加入适当的 DEPC 水溶解（沉淀可见，加入的 DEPC 水多一些，反之少加），静置后即可于 nanodrop 检测浓度（一般我们暂定 A260/A280 比值在 1.8-2.0 即可使用）。
cDNA 合成
说了这么多终于完成了第一大步，虽然步骤看似较多，但是掌握后还是蛮简单的，而且在做该步骤的时候还可以穿插很多其他的实验，非常不占用时间。
在小笔的实验中，采用的是 TransScript One-Step gDNA Removal and cDNASynthesis SuperMix 试剂盒，只需要根据试剂盒说明书的配比加入八连排管，设置好程序即可。
当然，每个实验室使用的试剂盒不同，具体根据各自实际情况来定，但是原理是相同的，最终得到 cDNA 产物即可，储存于-20℃ 备用。
RT-PCR
这部分其实是最简单也是最难的一步，简单在于只要把相应的引物，cDNA 产物，SubGreen 染料等以合适的比例混合在一起即可；而难点在于加样的精准性，会极大的影响实验的结果。
我以 ABI 7500fast 为例，采用 subgreen 荧光染料，按照以下反应体系进行配比：
序号 | 反应物 | 剂量 μL |
1 | 上游引物 Forward | 0.6 |
2 | 下游引物 Reverse | 0.6 |
3 | SubGreen 染料 | 10 |
4 | cDNA | 5 |
5 | DEPC 水 | 3.8 |
总 | 20 μL | |
反应温度为:
95℃ 预变性 3 min, 随后 40 个 PCR 循环（95℃ 3 seconds；60℃ 31 secends），最后加上溶解曲线即可。
最后得出以上这样的曲线，如何解读下期说啦。
备注：因为 ABI 的这台仪器可以全自动分析实验数据，操作较为简单。其他仪器要根据相应的操作手册来进行，要注意各自的反应体系和温度设置，不同仪器会略有差异。
最后几点重要的小提示：
1. 最后进行 PCR 后的 PCR 产物可以通过琼脂糖凝胶电泳来检测其产物是否是单一的扩增条带，小笔比较懒，较少采用该步骤。
2. PCR 引物的设计也是十分重要的环节。设计不合理，很容易 P 出不对的结果或者根本 P 不出来，下次有时间再专门讲解如何设计合适的引物。
3. 最最重要的是，提取 RNA 的所有的操作过程都要保证无污染，比如使用 RNAfree 的 EP 管，采用 DEPC 水，戴口罩和手套等等；PCR 的过程要保证精准度，新手可能一次性加满 96 孔板会导致复孔结果偏差很大，先少后多，保证质量，相信我，不然一溜加完加到手酸无比，也出不来好的结果的时候，你会崩溃的。
RT-PCR 从收细胞开始到最后出结果，看似时间很长，但是可以一次得到很多结果，还是属于高效性的实验，只要把握实验的关键技术难点，出数据是分分钟的事情，好啦，啰嗦到此，诸位使出洪荒之力好好做实验吧，如果在实验中太辛苦，生不如死的话，找我找我来帮你，哈哈哈！
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