做 WB 实验，你都碰到过哪些奇葩的条带

博士德生物学霸

相信很多人在做 Western blot 实验时，会遇到各式各样奇怪的现象，为了让大家少走弯路，下面就跟大家来分享一下实验过程中会出现哪些现象，是什么原因，如何来解决。【文末有锦鲤福利】

以下列举的情况可都是我们的实验员在多次实验中所积累的真实经验，内容文字少，全是干货。

1. 出现黑点或黑斑

原因：试剂污染，抗体结合到封闭剂

解决方法：使用新鲜配置的试剂；过滤封闭液；选用其他类型封闭液

2. 条带中出现边缘规则的白圈

原因：转膜时膜和胶中间有气泡，或抗体在膜上未均匀分散

解决方法：制备转膜凝胶时用玻棒赶去气泡；使用摇床孵育抗体

3. 条带拖尾

原因：样品有未溶颗粒；分离胶浓度偏大

解决方法：充分溶解，加样前离心；换小浓度分离胶

4. 条带扭曲，如微笑带

原因：胶未配好（凝胶未能完全聚合，胶中有颗粒或气泡，凝胶未冷却好，）；电压过高；

解决方法：正确添加质量合格且未过期的 AP 及 TEMED；过滤配胶的试剂保证配胶过程中胶内无气泡；凝胶冷却好后再上样；降低电压

5. 出现非均一性背景

原因：膜可能曾经干过

解决方法：在实验过程中要保证膜一直处于湿润状态

6. 条带中间出现白色（反白）

原因：中心部位高浓度 HRP 将底物消耗过快，中间部位底物消耗完后无法发光

解决方法：降低蛋白量，降低一抗与二抗的浓度

7. 高背景

原因	解决方法
抗体与其它蛋白质交叉反应	更换不同的封闭液；勿在 Biotin/avidin 体系中使用脱脂奶粉封闭降低二抗浓度检测二抗与膜的交叉反应性
一抗浓度过高	降低一抗浓度
漂洗不完全	增加漂洗时间和缓冲液体积漂洗液中加入 Tween20；浓度 0.05％
曝光时间太长	缩短曝光时间
膜的问题	使用干净镊子；戴手套操作；换一张新膜用足够的液体，膜始终保持湿润孵育时使用脱色摇床避免膜重叠，互相覆盖小心操作，勿毁损膜
洗膜不充分	增加洗涤次数
膜不合适	NC 膜比 PVDF 膜背景低
膜干燥	保证充分的反应液，避免出现干膜现象
缓冲液污染	使用新缓冲液过滤缓冲液

△ 调整一抗浓度

△ 调整封闭液浓度

△ 调整曝光时间

△ 调整封闭液种类

8. 非特异性条带（杂带）

原因	解决方法
SDS 非特异性结合到胶上的蛋白质	转膜后充分清洗 ; 不用 SDS
细胞传代次数过多，使其蛋白表达模式的分化	使用原始或传代少的细胞株，或平行实验
蛋白样本降解	使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂
新蛋白或同族蛋白的分享同种表位的不同剪接方式	查其它文献报导，或 BLAST 搜寻，使用说明书报导的细胞株或组织
抗体未纯化	使用单克隆或亲和纯化的抗体，减少非特异条带
蛋白存在二聚体或多聚体	SDS-PAGE 电泳上样前，加 DTT, 再煮沸变性，以增强蛋白质解聚变性
许多蛋白质有多个亚型，分子量不同	查阅文献或进行生物信息学分析，抗体针对几个亚型，就会有几个条带
蛋白本身有多个修饰位点	查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，确定分子量
一抗浓度过高	在满足一定的敏感性的情况下，降低一抗浓度
二抗引起的非特异条带	只加二抗做对照，检查非特异条带是否由二抗引起降低二抗孵育浓度更换交叉反应小的二抗抗小鼠二抗易和大鼠组织和细胞发生交叉反应，选用吸附过的二抗
上样量过高	适当减少上样量
洗涤不完全	可适当延长洗涤时间
封闭不好	延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液

另外，有些情况下的「杂带」带可能并不杂，例如

翻译后修饰对分子量的影响：