western blot 操作步骤详解

2016-08-11 12:36 来源:生物学霸 作者:dlzhangyu
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上回说到如何进行蛋白质的样品制备、蛋白质定量及 SDS-PAGE 电泳,如果你还没看过,点此详见:《献给初学者:western blot 操作步骤详解》。下面就跟大家讲讲接下来的步骤。

转膜

我们实验室使用的是半干转膜电泳槽。对于转印 90 kd 以下的蛋白,转膜液都不用加 SDS, 如果是蛋白分子量大的话可以加入 0.037% 的 SDS。

1. 在电泳结束前 20 min 开始准备转膜所需的东西。转一张膜需准备 6 张的滤纸(长一般为 8.1~8.3 cm,宽度根据裁的胶大小实际测量,但胶一般会缩水,所以裁 8 cm 就行)和 1 张 PVDF 膜。切滤纸和膜时一定要戴干净手套,因为手上的蛋白会污染膜。PVDF 膜使用前用无水甲醇中浸泡 1 min~2 min。目的是为了活化 PVDF 膜上面的正电基团,使它更容易跟带负电的蛋白质结合,做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。

2. 将玻璃板撬开才可剥胶,撬的时候动作要轻,要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动,直到撬去玻板(撬时一定要小心,玻板很脆弱,我用的是冰箱里附带的塑料除霜铲,效果出奇的好)。除去小玻璃板后,将浓缩胶轻轻刮去,要避免把分离胶刮破。也可取 10 ml 注射器吸满转印缓冲液,往玻璃板与凝胶之间注水,使液体的压力将两者自然分开。

取出凝胶后应注意分清上下,可以在右上角裁一个小角。之后有两种方法供选择,一是按照 marker 指示,把含有自己感兴趣的蛋白的胶裁下来,二是把整张胶转膜,前一种方法更加节约材料,但操作稍微麻烦了一点。在加有转移液的培养皿里放入裁好的胶、浸过甲醇的 PVDF 膜和滤纸,平衡 10 min 左右,也是为了除去滤纸和转移膜中的气泡以及胶上多余的 SDS。

3. 带上手套,平放转移槽的底座,依次在石墨电极上叠放 3 张浸泡过缓冲液的滤纸、PVDF 膜(此时可在 PVDF 右上角减去一个角,以辨明转膜后的蛋白面与非蛋白面)、刚刚完成电泳的凝胶和另外 3 张浸泡过缓冲液的滤纸。用枪头或移液管在叠层的滤纸上滚动,除去气泡。注意每叠一层就要用玻璃棒或圆筒试管赶去气泡,因为一个气泡的厚度对于蛋白来说都是十万八千里的。

用干净纱布将叠层上面和周围的多余缓冲液吸干(这一步很重要,宁可太干也不能太湿,太干容易烧胡,太湿的话多余的缓冲液会导致电流短路,大大降低转移效率,如果同时转好几条胶的时候更要小心,有一个胶短路就会影响整体的转移效率)。最后将转移槽的上盖扣上,接通电源开始转膜。

由于设备昂贵,第一次操作应向熟手请教,否则短路可能烧坏设备!转完后立即清洗设备,特别是金属上盖,转膜液特别容易在金属上盖上形成结痂,影响设备的正常使用,我们实验室今年做 western 的同志因为忽略这一点,转膜仪烧坏了好几次。

4. 依据分子量大小电泳 15~60 min。如果初次转膜,可以根据一般经验,即多少 kD 的蛋白就转多少分钟,再根据结果调整时间。之后断开电源,取出转移膜进行后继实验。

5. 为了便于观察电泳效果和转膜效果,以及判断蛋白分子量大小,最好使用预染。传统方法是将膜用 1×丽春红染液染 5 min(于脱色摇床上摇)。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。实际上更常用且简便的方法是先将膜晾干,然后浸入 20% 的甲醇,待完全浸湿后取出透光观察即可看到蛋白条带(此方法仅仅适合 PVDF 膜)。将膜晾干备用。使用预染 marker 话可以看见 marker 的颜色转印到了膜上,但是凭借这个颜色来判断是否转印完全或转印过头是不可靠的。

免疫杂交反应

1. 将膜移至含有封闭液的平皿中,室温下脱色摇床上摇动封闭 1 h 即可。如果是自己配置的封闭液,最好过滤一下以消除固体杂质。实际经验表明与其封闭过夜,不如一抗孵育过夜。

2. 将一抗用封闭液稀释(一般用封闭液稀释即可,如果背景不高用 TBST 稀释也可以,当然熟练后还可以自由发挥,配制一些自己的复方稀释液)至适当浓度(可以在 1.5 mlEP 管中配置工作液,常用稀释倍数为 1:200,1:500,1:1 000,具体需要预实验进行摸索,用后可回收重复用 2~3 次,但回收重复利用的效果如何就要看抗体的质量,分装的抗体不推荐回收。稀释后应在 2-3 天内使用,4 度保存,避免反复冻融。)

撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上,四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整;将抗体溶液加到保鲜膜上;从封闭液中取出膜,用滤纸吸去残留液后,将膜蛋白面朝下放于抗体液面上,掀动膜四角以赶出残留气泡(也可使用手术室的病理袋,质量不错,减去下面的折叠部分,用封口器(40~80 元一个)封上,不漏液即可)。37° 孵育 1 h 之后转移到室温下再孵育 1 h(或者 4°孵育过夜),用 TBST 在室温下脱色摇床上洗两次,每次 10 min;再用 TBS 洗一次,10 min。也可以多洗几次,比如 4 次,每次 5 min。

3. 在培养皿内加入二抗稀释液(10 ml 足够了,一般 1:1 000 甚至 1:10 000 用 TBST 稀释),放在摇床上,室温下孵育 1~2 h 后,用 TBST 在室温下脱色摇床上洗两次,每次 10 min;再用 TBS 洗一次,10 min, 进行化学发光反应。选择好一个合适的条件不要轻易改变,另外相比一抗,二抗作用的时间应严格控制,实践证明一抗时间长点可能没什么关系,而二抗时间若过长过短都将会直接影响结果。二抗孵育之后还要注意好好洗涤,否则显影是背景可能脏。

化学发光(ECL),显影,定影

1. 现在工作台上铺一张保鲜膜,将 PVDF 膜放在保鲜膜上。将 ECL 的 A 和 B 两种试剂在 EP 管内等体积混合(注意吸完 A 试剂后吸 B 试剂前要患枪头),然后均匀滴在 PVDF 膜的蛋白面,反应 1~2 min 后,将 PVDF 膜上多余的 ECL 工作液吸干,之后转移到在 X 片夹中预先铺好的保鲜膜上一侧,把另一侧翻过来盖在其上。用透明胶把保鲜膜固定在片夹上。

2. 在暗室中,将 1×显影液和定影液分别到入塑料盘中;在红灯下取出 X-光片,用切纸刀剪裁适当大小(比膜的长和宽均需大 1 cm);打开 X-光片夹,把 X-光片放在膜上,一旦放上,便不能移动,关上 X-光片夹,开始计时;根据信号的强弱适当调整曝光时间,一般为 1 min 到 2 min,也可选择不同时间多次压片,以达最佳效果(也有人重叠压好几张片,固定曝光 5~10 分钟,从这好几张片中选出最合适的底片);曝光完成后,打开 X-光片夹,取出 X-光片,迅速浸入显影液中显影,待出现明显条带后,即刻终止显影。

显影时间一般为 1~2 min(20~25℃),温度过低时(低于 16℃)需适当延长显影时间;显影结束后,马上把 X-光片浸入定影液中,定影时间一般为 5~10 min, 以胶片透明为止;用自来水冲去残留的定影液后,室温下晾干(注意:显影和定影需移动胶片时,尽量拿胶片一角,手指甲不要划伤胶片,否则会对结果产生影响)。

X 光片一般选用柯达原装的生物实验专用柯达 X-OMATBT 胶片 . 显影液和定影液最好每周配置一次,避光室温保存,显影和定影液是最便宜的试剂了,千万不要因为它而影响了整个结果。

凝胶图象分析

将胶片进行扫描或拍照,用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值,比如 bio-rad 的 Quantity One。如何使用敬请关注我们下一期内容。

主要参考资料

WB 实战指南+正确使用 Quantity One 定量 by jacqueslm2001

Abcam 的 western 新手指南

土豆网的 western blot 视频 上海交大出品

《分子克隆实验指南》精编版 化学工业出版社

《抗体技术实验指南》科学技术出版社

milipore 的 western blot 的优化方案

Western blot 步步看--网络流传最广的资料,作者不详

Bio-rad 蛋白印迹手册

穷人的劳斯莱斯-我的五年 western blot 体会

附:Western Blot Quick Guide 以及一天跑完 Western 的时间规划

1. 前期准备:蛋白已经定量,各样本已经稀释到某固定浓度,已经和 SDS loading buffer 混合,已经分装好,保存与 -20°。头天下午或晚上配胶,分离胶和浓缩胶一起配好,带上梳子,放入潮湿的自封袋内放入 4° 冰箱备用。

2. 8:00 从冰箱里取出蛋白样品,用 PCR 仪 95 度加热 5 min。混合均匀并离心。

3. 8:30 取出昨晚配好的胶,组合,加电泳液。在电泳液里拔梳子能稍微容易一些。用 10 uL 的枪加样。

4. 9:00 开始电泳。恒流 30 mA 一般 1 个小时足够了。

5. 9:30 开始准备转膜用的滤纸和 PVDF 膜,PVDF 膜泡甲醇。一般 8 cm 的宽是固定的,所以如果要裁胶的话可以先大概估计一下。

6. 10:10 电泳结束(假设电泳用了 70 min),起开玻璃板,裁出胶上所要的条带,如果整块胶转就更方便了。把胶放在盛有转膜缓冲液的培养皿里。

7. 11:00 转膜开始(这里裁纸和铺三明治还是比较费时间的,我一般要用 30 ~ 50 min,所以这里要抓紧时间)。

8. 12:00 转膜结束(这里按 60 min 的半干转的时间来计算)。开始封闭 1 h。

9. 13:00 封闭结束,开始孵育一抗(在这里你可以选择一抗孵育过夜,如果不过夜的那一天就能结束),如果不过夜的话我一般选择 37° 1 h 然后在室温(23°左右)再 1 h。

10. 15:00 一抗孵育结束。TBST 洗涤 3*10 min 或者 5*6 min。

11. 15:30 开始孵育二抗。室温 1 h 足够了。

12. 16:30 二抗孵育结束。TBST 洗涤 3*10 min 或者 5*6 min,这里推荐采用 5*6 min。

13. 17:00 ECL 发光,压片 10 min,显影 1 min,定影 10 min,那么在 18:00 之前你就能看到结果。如果结果不好还有后招,用 stripping(一抗二抗洗脱液)洗涤,我用的是碧云天的碱性一抗二抗洗脱液,按照说明书来一般 20 min 就行,然后洗涤几次,重新封闭 1 h,然后一抗过夜,明日再继续战斗。这样的话 18:30 之前也能结束战斗。

文章来源:丁香园站友 @dlzhangyu

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编辑: 任悠悠

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