「神药」能不能用,关键还要看这项技术的检测结果

2018-08-28 09:23 来源:丁香园 作者:
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《我不是药神》收割电影票房的步子渐渐慢慢了下来,但它引发争议和讨论仍未停息。


图片来源:SOOGIF


的确,在肿瘤领域,近年来涌现的靶向治疗药物和免疫治疗药物极大地改善了患者的预后及生活质量,赋之以「神药」的美名丝毫不过分。不过,神药的神力并非无远弗届,需要经由基因检测来筛选合适的患者方能对症下药,而以下一代测序为代表高通量测序技术便是当下最为高效精准的基因检测解决方案。


NGS 开启精准医学新范式


高通量测序技术(High-throughput sequencing)又称「下一代」测序技术(Next-generation sequencing technology,NGS),以能一次并行对几十万到几百万条 DNA 分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。


NGS 的诞生是基因组学研究领域一个具有里程碑意义的事件。该技术使得核酸测序的单碱基成本与第一代测序技术相比急剧下降,以人类基因组测序为例,上世纪末进行的人类基因组计划花费 30 亿美元解码了人类生命密码,而第二代测序使得人类基因组测序已进入 1000 美元基因组时代(仅试剂成本费用)。


目前,无创产前检测(Non-invasive Prenatal Testing,NIPT)和肿瘤的液体活检是 NGS 应用相对成熟和广泛的两个领域。


NIPT 是针对孕妇外周血浆中来自母体和胚胎的游离 DNA 片段,利用 NGS 高通量测序技术测序检测以及特定的数模计算,分析胎儿是否发生染色体非整倍体(21、18、13 三体综合征)变异的一项检测技术。


肿瘤液体活检可以分析循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)、循环肿瘤 DNA(circulating tumor  DNA , ctDNA)和细胞外囊泡。其中 ctDNA 检测是通过分析血液循环中的肿瘤突变 DNA 来判断患者肿瘤的基因特征,而 CTCs 则通过检测血液循环中的肿瘤细胞来获取病变信息,从而帮助医生建立基因表达谱、靶向突变用药、快速判断疗效、监测耐药的发生、随肿瘤的发展而调整治疗方案。


NGS 应用流程如图 1 所示:


图 1:基于不同测序应用的 NGS 样本制备流程图


三款 NGS 液体工作站,总有您的 Style


随着精准医疗理念的深入人心以及 NGS 技术应用范围的逐步扩大,越来越多的样本涌入第三方医学检验机构(目前第三方医学检验所 500 多家)。大量的样本令检验工作者应接不暇,凸显人工操作工作效率低、容易出现误差、重复性不好等弊端。而液体工作站有着高通量,样本重复性好,人为差错的概率低,成本低的优势,使用液体工作站代替检验人员进行游离 DNA(cell-free DNA,cfDNA)的提取、建库和捕获日渐趋势。


目前,珀金埃尔默(PerkinElmer)针对这一市场需求,已推出 NGS Express、Sciclone G3 NGSx 和 Zephye NGS 三款液体工作站。


图 2:NGS Express 及其工作台面图


图 3:Sciclone G3 NGSx 及其工作台面图


图 4:Zephyr NGS 及其工作台面图


三款产品有着不同的定位,其详细配置见表 1 所示。


表 1:NGS Express、Sciclone NGSx 和 Zephye NGS 三款液体工作站配置表


好不好用?给您实锤的证据


从上面的表格可以看出,3 款 NGS 液体工作站在具备相当丰富的功能和非常体贴的细节设计的同时,又各具特色,拥有丰富的适用场景,那么这些液体工作站实际的应用又如何:它能够减少人工误差吗?它的提取效率和效果能与手动一样或者更高吗?它能降低单个检测样本的费用吗?


下面以 Sciclone NGSx 液体液体工作站在肿瘤靶基因检测中 KAPA 试剂建库和 IDT 试剂捕获为例,逐一回答上述三个问题。


A:客户 A 选取同一个样本分成 9 个样本,8 个样本用于自动化提取,1 个样本用于手工提取。其中,每个样本的基因组起始量为 200 ng,片段化后的样本以 KAPA 的 protocol 为操作指导在 Sciclone NGSx 上建库。建库结束后用 Qubit 3.0 测定浓度并用 LabChip® GX II Touch HT 测定片段大小。结果如下表:


表 2:手动建库与自动建库文库浓度表

图 5:文库片段大小分布的 LabChip 结果表 

注:图片来源于 X-mark 芯片和 NGS3K 试剂的结果。Test-1,Test-2,Test-3 和 Test-4 样本 1:20 稀释后上样。


以上结果表明,自动化建库与手动建库无显著差异,且片段大小分布均一。


自动建库与手工建库的结果无显著差异,IDT 试剂的捕获结果又是如何呢?同样取 8 个 pooling 样本,按照 IDT 的捕获 protocol 作为操作参考。随后用二代测序仪上机测试,结果如下:


表 3:8 个 pooling 样本的捕获文库核酸浓度表


图 6:自动捕获与手动捕获的 on –target 数据比对图

注:Test-6 客户测序数量限制,仅足够进行 7 个样本的测序。


捕获文库的核酸浓度与手工提取无显著差异,On-target 参数上,液体工作站全面大于手工操作的样本。


B:客户 B 准备 7 个样本,用于手动,A company 液体工作站与 PerkinElmer 公司液体工作站比较。同样是片段化后的样本以 KAPA 的 protocol 为操作指导在 Sciclone NGSx 上建库。


图 7:手动实验/A company 液体工作站与 PerkinElmer 公司液体工作站建库后文库浓度比较图


PerkinElmer 液体工作站建库的样本浓度略低于捕获前建库的文库浓度,与 A company 的液体工作站文库浓度无显著差异。


将文库混合成 pooling 样本后,按照 IDT 的捕获 protocol 作为操作参考,做捕获测序。


图 8:手动、A company 液体工作站与 PerkinElmer 公司液体工作站捕获的 On-target 参数比较图


由图 8 可知,相对于液体工作站,文库捕获手动操作在 On-target 参数上不够稳定,PerkinElmer 公司液体工作站在 On-target 参数上略优于 A company 公司的液体工作站。


另以上述两个客户的试剂方案为例,完成 96 个样本的建库与捕获过程需要约 6 个实验人员 2 天时间,而选用 PerkinElmer 的液体工作站仅需要 1 个实验员约 1.5 天时间即可。使用 PerkinElmer 液体工作站,在节约人工成本方面,无疑是显著的;另一方面,如客户 B 的示例,实验人员手工操作,不可避免会有失误,而 PerkinElmer 液体工作站的高稳定性降低甚至避免了人为操作过程中的误差或失误所导致的测序 QC 不达标甚至失败的风险,为本来就花费颇高的二代测序在无形中降低了成本。


综上所述,PerkinElmer 工作站在 NGS 领域,无论是速度、稳定性、性价比方面都会给您带来 Yes 三连击的答案。


图片来源:SOOGIF


看到这里,您或许对 PerkinElmer 的这 3 款 NGS 液体工作站从配置、性能到试剂操作都有了一定了解,那么心动不如行动,行动造就成功,快来体验一下吧。


NGS 液体工作站

编辑: 高薇

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