从生物体液分离外泌体的各种方法已被开发出来。它们包括离心，色谱，过滤，基于聚合物的沉淀和免疫学分离。这些方法最近的技术进步使分离过程更快更容易。非外泌体颗粒造成的分离后的外泌体污染可导致关于获得的外泌体生物活性的错误结论，因此应该避免。来自不同标本的外泌体可能拥有不同的蛋白质或脂类，管腔内容物和不同的沉积特征。

差速离心仍是外泌体分离的最常见技术之一。该方法有几个步骤，包括：1）低速离心以除去细胞和细胞凋亡碎片，2）高速离心以消除大囊泡和3）高速离心以沉淀外泌体（图1）。重要的是，生物体液的粘度与分离的外泌体的纯度有显著的相关性 [4] 。而且，高粘度的生物样品需要更长的超速离心步骤和更高的离心速度。

图 1. 差速离心。分离外泌体需几轮离心。连续两轮的离心时间增加以沉淀较小的颗粒。每次离心后，将含有细胞碎片的沉淀物除去，上清液用于下一步骤。与此相反，100000×g离心后，保留外泌体颗粒用于进一步的分析，并且除去上清液 [1] 。

此方法以蔗糖密度梯度超速离心 [5] 。更具体地说，密度梯度离心用于从非囊泡粒子，如蛋白质，蛋白质/ RNA的聚集体中分离外泌体。因此，这种方法从不同密度的颗粒分离出囊泡。充足的离心时间是非常重要的，否则如果外泌体和颗粒密度相似，外泌体部分可以仍然发现颗粒污染。最近的研究建议进行离心前把超速离心得到的外泌体沉淀加到蔗糖梯度 [6] 。

图 2. 旨在分离外泌体的纤毛多孔结构。该结构让细胞和其他大于1微米的颗粒不能进入有线区域。一些较小的颗粒和细胞碎片可以进入微柱区域，但排除在纳柱区域外，上面有直径30-200纳米的孔。纤毛结构选择性地捕获外泌体和小的胞外囊泡 [2] 。

体积排阻层析分离大分子基于大小，而不是分子量。该技术运用填充有多孔多通道的多孔聚合珠柱子。分子穿过珠子取决于它们的直径。小半径分子花费较长时间通过柱子的孔移动，而大分子较快从柱洗出。体积排阻层析允许大分子和小分子的精确分离。此外，这种方法可使用不同的洗脱溶液。色谱分离已被证明比离心方法有更多的优点，因为用色谱分离的外泌体不会受到可能改变囊泡的结构的剪切力影响 [7] 。

超滤膜可以用于外泌体的隔离。根据微泡的大小，该方法允许外泌体从蛋白质等大分子分离出来。外泌体也可把他们困于一个多孔结构（图2）而分离出来。最常见的过滤膜有孔径0.8微米，0.45微米或0.22微米，可用于收集大于800纳米，400纳米或200纳米的外泌体。特别的是，微柱的多孔硅纤毛结构为分离40-100纳米外泌体而设计 [2] 。在最初的步骤中，较大的囊泡被除去。在接下来的步骤中，外泌体集中在过滤膜。分离步骤比较短，但该方法需要用PBS缓冲液预温育硅结构。在接下来的步骤中，外泌体集中在过滤膜。这种方法还没有使用临床样品进行测试。

图 3. 外泌体过滤筛分模型。筛分由（a）在芯片上过滤器加压或（b）产生电场而成，迫使外泌体通过多孔膜，结合了横流和电泳分选 [3] 。

基于聚合物的沉淀技术通常包括将含有聚合物的沉淀溶液与生物体液混合，4℃温育，低速离心。用于基于聚合物的沉淀最常见的聚合物之一是聚乙二醇（PEG）。使用该聚合物的沉淀具有许多优点，包括对分离的外泌体温和的影响和使用中性pH。几个商业试剂盒把PEG应用于分离外泌体。最常用的试剂盒是ExoQuick™（System Biosciences，Mountain View，CA，USA）。该试剂盒使用容易和快速，不需要额外的设备。最近的研究表明，用ExoQuick™以超离心方法获得的外泌体产量最高 [8] 。然而，非外泌体材料的污染仍是基于聚合物的外泌体分离方法中的问题。此外，存在于分离物中的聚合物物质可能干扰下游分析。

外泌体的免疫学分离的几种技术已被开发。免疫芯片方法基于外泌体表面受体，它被用来根据来源分离外泌体。得到的外泌体直接用于分析或用于DNA或总RNA分离 [9] 。外泌体细胞内的蛋白质可以用作分离外泌体的特异性标记 [10] 。抗体包被的磁性小珠有效地用于从抗原呈递细胞分离外泌体 [11] 。此外，使用抗肿瘤相关的HER2和EpCAM抗体从肿瘤细胞中分离出来源于肿瘤的外泌体 [12] 。分离的珠子-外泌体复合物可通过流式细胞仪，Western印迹和电子显微镜来分析 [13] 。然而，使用抗体包被的珠子分离法不适合从大量样本获得外泌体 [13] 。

此外，基于ELISA 的ExoTEST™被证明是有效的外泌体分离法 [14] 。利用包被外泌体抗体的ExoTEST™板，外泌体可从各种生物液体中分离出来。该方法应用于检测，分析和定量普通外泌体蛋白质和细胞类型特异性外泌体蛋白质。

该技术通过膜和由压力或电泳（图3）进行过滤，从生物液体中筛分出外泌体 [3] 。该方法需要更短的间隔周期，但分离到的外泌体纯度更高 [15] 。对于特定类型的外泌体，这种方法被认为无法选择。筛分分离的唯一缺点是分离的外泌体回收率低。

分泌的外泌体在不同的疾病，包括肿瘤的发病机理中具有重要功能。几种方法已经被开发，用于从生物体液获得并分离外泌体。离心技术仍然很常见的，但是，其它的方法，如过滤，免疫学分离和筛分，也有满意的结果，并且可以有效地应用于实验室研究和临床医药。

外泌体是在正常和病理条件下通过细胞分泌的，并含有各种膜蛋白和细胞质蛋白。因此，外泌体蛋白可能用于临床诊断（图2）。在外泌体中发现十大蛋白包括热休克蛋白8（HSPA8），CD63抗原（CD63），肌动蛋白，β（ACTB），甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH），烯醇酶1，α（ENO1），热休克蛋白90AA1（HSP90AA1），CD9抗原（CD9），CD81抗原（CD81），酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白，ζ多肽（YWHAZ），丙酮酸激酶，肌肉（PKM2） [10] 。外泌体蛋白质属于各种官能团，如四旋蛋白（CD9，CD63和CD81），热休克蛋白（HSC70和HSC90），膜转运（GTP酶）和脂质结合蛋白。

四旋蛋白是常见的外泌体特异性标志物。它们包括CD9，CD63和CD81的膜蛋白。 四旋蛋白可用于各种肿瘤和传染病的诊断。特别是，CD63+外泌体在黑素瘤和其它癌症病人中显著增加 [14, 16] 。因此，CD63被建议是癌症的蛋白质标志物。此外，CD81，四旋家族的另一成员，在丙型肝炎病毒进入细胞中发挥重要作用。外泌体CD81被证明在慢性丙型肝炎病人 [30] 血清中显著增加，表明CD81可用于丙型肝炎病毒感染的诊断标志物。

几个外泌体蛋白质可能在脑肿瘤和中枢神经系统的其他疾病诊断中起有效作用。胶质母细胞瘤特异表皮生长因子受体VIII（EGFRvIII）可能是胶质母细胞瘤的一个特异标记 [19] 。对于中枢神经系统，EGFR，EGFRvIII和TGFβ可以在从脑肿瘤病人的血清中分离的外泌体中检测出来 [19] 。此外，苏氨酸181磷酸化的tau蛋白可在从阿尔茨海默氏病患者的脑脊髓液样品， 获得的外泌体中进行检测 [31] 。苏氨酸181磷酸化的tau蛋白是阿尔茨海默氏病的既定的生物标志物。此外，α-突触核蛋白，一种在帕金森氏病的发病机制中起重要作用的肽，可在帕金森氏病的体外模型中获得的外泌体中发现 [32] 。此外，受朊病毒感染的神经元产生的外泌体中检测到朊病毒蛋白 [33] 。

尿源外泌体检出各种外泌体标记物，并且可以被应用于泌尿系疾病的诊断。两个尿源外泌体标记，胎球蛋白A和转录激活标识物3，在急性肾损伤病人中增加 [25, 26] 。另外，在尿液中发现的外泌体标记物也可能是膀胱和前列腺肿瘤的标志物。尿源外泌体检测到的几个尿源外泌体分子在膀胱癌患者中增加。它们包括视黄酸诱导的蛋白3和抵抗素 [23] 。此外，两个尿源外泌体蛋白质，PCA-3和TMPRSS2：ERG，被证明与前列腺癌相关联 [20] 。

除了脑和泌尿道肿瘤，外泌体蛋白质，也可用于胰腺癌特异性标记。梅洛等人最近的一项研究已经表明，细胞表面蛋白聚糖，磷脂酰肌醇聚糖-1（GPC1），富集与从胰腺癌细胞分离的外泌体 [24] 。此外，GPC1+外泌体的减少是预示着患者生存率的预后标记。这项研究结果在老鼠自发胰腺肿瘤证实。

除了蛋白质，外泌体中也含有RNA [34] 。外泌体的miRNA可应用于各种肿瘤（图3）的诊断。八种miRNA被确定为卵巢癌的特异标记 [35] 。此外，据报道miRNA在肺腺癌病人的血清和肿瘤样品中增加，这使得它们对于肺腺癌的诊断非常有用 [36] 。此外，有发现血清外泌体的miRNA，miR-141和miR-375的水平升高与前列腺癌的恶化相关 [37] 。此外，外泌体miRNA可以是食管鳞状细胞癌（ESCC）特异性标志物。最近的研究显示食管癌患者血清外泌体的miRNA-21 [38] 和miRNA-1246 [39] 的水平上升。此外，miRNA-1246的上升与转移阶段相关，因此也低生存率相关。有趣的是，外泌体miRNA可以用作肾纤维化 [40] 和心血管疾病 [41] 潜在的诊断标记。星形细胞的外泌体miR-19A已被证明下调PTEN，一种肿瘤抑制，并促成脑转移 [42] 。

除了血清和尿，其它生物流体也可以作为外泌体的来源。特别是，从唾液中分离的外泌体证明含有胰腺癌 [47] 的诊断生物标志物。此外，外泌体已经从羊水中分离出来，说明其新生儿诊断 [48] 的应用潜力。一些miRNA在羊水检测出来，并表现出与怀孕周期 [49] 相关。

相比其他在生物体液如血清或尿液中发现的生物标志物，外泌体生物标记表现出较高的特异性和稳定性。这使得外泌体生物标志物对于临床诊断很重要。新的分离方法的发展使得用外泌体作出诊断更经济有效。外泌体的各种部件，诸如外泌体蛋白质，miRNA和脂质可以有效地用于诊断。然而，外泌体标志物用于临床诊断的潜在重要性还有待进一步调查。