历时2年做出的实验结果，终于在文章投出的时候轻松片刻！但是，一个不留神就可能被要求补数据！

 

What？RNAi的坑到底在哪？
 

为了让大家避免“万事具备、只欠东风”的尴尬，今天就给聊一聊RNAi研究怎样避坑。
 

RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发、同源RNA高效特异性降解的现象，通常用于降低特定基因的RNA水平。
 

但在实际应用中，众多科研工作者只注重功能变化，忽略了RNAi技术缺点——脱靶（Off-Target：非靶基因抑制），若脱靶基因与靶基因位于同一信号通路或者与表型相关，则容易出现假阳性，对实验结果产生干扰，那么如何在实验设计前端就避免呢？我们先看下靶点设计过程：

图1

防止脱靶的第一步是Blast比对，即将靶点与对应物种核酸数据库比对，确保其与非靶基因含有至少3个以上碱基错配。
 

这就够了吗？NO!
 

按照Nature的标准，一个严格的RNAi介导knockdown实验要有6个对照：

 

以上六组对照，前三组是基础；第6组鲜有文献涉及，可以舍去；4或者5任做一组即可，若提交的文章不含组4、5，审稿人会依据自己的偏好做指定要求。两种方法对应的实验分组如下：

 

RNAi+crispr/cas9搭配^[1]

 

双靶点筛选^[2]                                                                rescue实验^[3]

审稿人对脱靶的担忧是多余的吗？我们再看看脱靶数据及原因：

一 、siRNA剂量引发脱靶效应

高浓度的siRNA与非靶基因结合概率增大，从而诱发off-target。
 

Caffrey^[4]做了不同浓度的脱靶研究，以图2红框内前三个STAT3靶点为例，25nM、10nM、1nM的siRNA分别造成38、1、0个脱靶。由此可见，1~2倍的siRNA剂量差异可引发指数级的脱靶效应。而大多数全基因组和生物筛选的siRNA浓度通常为25nM至100nM，远高于文章使用的剂量，且载体表达的siRNA依靠U6、H1启动子表达，siRNA剂量因启动子在不同细胞活性差异以及siRNA本身结构的影响，无法精确控制siRNA浓度。

 

图2

 

二、siRNA种子区引发脱靶效应

miRNA主要依靠种子区（seed region,指成熟体5’端 2-8个碱基）与靶基因的3'UTR区结合,抑制翻译。siRNA同miRNA产生机制类似（图3），也可通过种子区结合特征产生非靶抑制现象。图2数据显示，非靶基因下调总数/符合种子区特征：56/32，30/22（以前两个为例）；Jackson^[5]也论述了脱靶效应与seed region的对应关系（图4），seed region结合占脱靶比率超过50%(而脱靶引发的上调不符合种子区结合原则)。

 

图3
 

浅蓝色表示下调的转录物；红色表示上调的转录物；灰色表示无显著变化的转录物；深蓝色表示符合种子区结合的下调转录物；序列表示靶点并标记出种子区
 

图4

 

RNAi天生带有原罪，载体表达的siRNA剂量不可控；siRNA依靠部分碱基结合非靶基因诱发的脱靶效应无法避免；经过dsRNA剪切产生的siRNA正义链也可参与脱靶效应……因此，实验设计的合理性至关重要。
 

如果您在做这方面的研究，但是还未做4或5的对照，小编强烈建议您赶紧补充一下吧，以免投稿后再补充数据。
 

如果您有相关问题，请给我们留言！吉凯病毒专家在您身边哦~
 

参考文献：

1.MLL3 Is a Haploinsufficient 7q Tumor Suppressor in Acute Myeloid Leukemia

2. The tumor suppressor CDKN3 controls mitosis

3. Ovol2 knockdown phenotype is rescued by expression of shRNA-resistant mutant Ovol2

4. siRNA Off-Target Effects Can Be Reduced at Concentrations That Match Their Individual Potency

5.Widespread siRNA “off-target” transcript silencing mediated by seed region sequence complementarity